Als Kind spielte Preston in Los Angeles als Kirchenorganist. 1956 begleitete er Mahalia Jackson in einer Fernsehshow. Im Film St. Louis Blues spielte er den jungen W. C. Handy.

1962 kam er mit Little Richard erstmals nach Europa und trat in Hamburg im Star-Club mit den noch unbekannten Beatles auf. Danach begleitete er u.a. Sam Cooke und Ray Charles.

Neben seiner Tätigkeit als Gastmusiker nahm er seit Mitte der 1960er Jahre immer wieder auch eigene Platten auf, von denen sich einige Singles in den Charts platzieren konnten (u.a. „Will It Go Round in Circles“ (eine US-Nummer-Eins 1973), „Nothing from Nothing“ (eine US-Nummer-Eins 1974), „With You I'm Born Again“ (Duett mit Syreeta aus dem Kinofilm „Die Chance seines Lebens“) (1979)). Zusammen mit Bruce Fischer und Dennis Wilson (Text) schrieb er das elegische „You Are So Beautiful“, das später von Joe Cocker erfolgreich gecovert wurde. Der Titel gehört zu den am häufigsten gecoverten Liedern der Popmusik.

Der Stil seiner Soloprojekte entwickelte sich im Laufe seiner Karriere. Waren es zunächst von Ray Charles und Gospelmusik inspirierte R&B-Instrumentaltitel, so wandelte er sich in den 1970ern zu einem Interpreten tanzbarer schneller Soulmusik. Seine Duette mit Stevie Wonders Ex-Frau Syreeta Wright waren dagegen langsame Balladen.

Die Beatles holten Preston für ihre Alben The Beatles, Let It Be und Abbey Road nach London. Beim letzten Auftritt der Beatles auf dem Dach des Apple-Hauses in der Londoner Savile Row spielte er das E-Piano. Die Zusammenarbeit setzte er mit den einzelnen Beatles (außer Paul McCartney) auf ihren Solopfaden fort und nahm 1971 am Konzert für Bangladesh und 2002 am "Concert for George" in der Royal Albert Hall teil.

Bei den Rolling Stones spielte Preston auf den Alben Exile on Main Street und Goat's Head Soup als Gastmusiker. Außerdem begleitete er sie als Keyboarder auf der Europatournee 1973, wo er mit Stones-Gitarrist Mick Taylor in der Begleitband im Vorprogramm spielte und auch ein Live-Album aufnahm. In den Rolling-Stones-Konzerten rundete Preston die brillanten Darbietungen der Band mit seinen musikalischen Beiträgen kongenial ab (besonders eindrücklich dokumentiert auf den Bootlegs The Stars In The Sky They Never Lie und Brussels Affair). Bei den US-Tournee 1975 und der Europa-Tournee 1976 nahm Preston in der Band einen so prominenten Platz ein, dass seine Hits Nothing from nothing und Outta space im Konzert gespielt wurden. Seine laszive Show gemeinsam mit Mick Jagger sorgte darüber hinaus wegen ihrer homoerotischen Anklänge bei beiden Tourneen für Aufsehen.

Später war Preston - vielleicht auf Grund von Suchtproblemen - nicht mehr bei Projekten der Rolling Stones beteiligt. 2001 spielte er das Clavinet für die Single Just Because von Nikka Costa. Als begleitender Keyboarder und Organist ging er auch mit Eric Clapton regelmäßig auf Tour, so noch zuletzt 2004 bei Claptons Europatournee, die ihn auch nach Deutschland führte. Außerdem arbeitete er mit so unterschiedlichen Künstlern wie Aretha Franklin, Sly & the Family Stone oder Bob Dylan zusammen und war auch an der letzten CD von Ray Charles ("Genius Loves Company" aus dem Jahre 2004) beteiligt.

Der unverwechselbare Stil seines Hammond-Orgel-Spiels, der sich durch virtuose Glissandi und einfühlsame Melodieführung auswies, machte ihn zu einem der begehrtesten Session-Musiker und wurde in besonderer Weise 1996 von Joe Cocker mit dem gemeinsamen Album Organic gewürdigt.

1992 war Preston wegen Drogenbesitzes verurteilt worden und hatte eine Entziehungskur hinter sich gebracht. Seine Gesundheit war durch jahrelangen Missbrauch von Drogen und Alkohol angegriffen, seine Nieren nicht voll funktionsfähig. Daran änderte auch eine Transplantation Anfang der 2000er Jahre nichts. 1997 war er wegen Verstoßes gegen Bewährungsauflagen zu drei Jahren Haft verurteilt worden.

Am 21. November 2005 fiel er in Folge hohen Blutdrucks und Komplikationen wie Nie