(In der Kirche Sant’Andrea della Valle)

Der politische Gefangene Angelotti flieht aus dem Staatsgefängnis Engelsburg in die Kirche Sant’Andrea della Valle und versteckt sich dort in der Familienkapelle der Attavanti, für welche ihm seine Schwester den Schlüssel versteckt hinterlegt hat. Der Maler Cavaradossi, ein Freund Angelottis, gestaltet in dieser Kirche das Altarbild, in dem er die Gestalt der Maria Magdalena nach dem Vorbild einer schönen Unbekannten gezeichnet hat, die in letzter Zeit oft in der Kirche zu sehen war. Zwar räumt Cavaradossi ein, dass die Unbekannte ihm als Modell gedient habe, beteuert aber, sein Herz gehöre allein seiner Geliebten, der Sängerin und Primadonna Floria Tosca.

Cavaradossi will seinem Freund Angelotti weiterhelfen. Cavaradossi verschließt die Tür, um Angelotti zu schützen und um nicht überrascht zu werden. Da erscheint Tosca. Die verschlossene Tür macht sie eifersüchtig, sie beschuldigt Cavaradossi der Untreue. Zwar kann Cavaradossi die Situation entschärfen und ein Treffen für den Abend verabreden. Aber die Eifersucht Toscas entflammt erneut, als sie auf dem von Cavaradossi gemalten Bild die Gräfin Attavanti erkennt.

Zur gleichen Zeit wird die Flucht Angelottis bemerkt und Alarm durch einen Kanonenschuss geschlagen. Cavaradossi versteckt Angelotti in einer kleinen Höhle im Brunnenschacht hinter seinem Haus.

Der Messner (Küster) betritt die Kirche und teilt mit, die italienischen und österreichischen Truppen hätten Napoléon Bonaparte in der Schlacht bei Marengo geschlagen. Der Polizeichef Baron Scarpia, der die Verfolgung Angelottis aufgenommen hat, betritt die Kirche. Tosca kehrt in die Kirche zurück, um Cavaradossi mitzuteilen, dass sie abends auf dem Siegesfest singen solle. Dabei schürt Scarpia ihre Eifersucht, um von ihr etwas zu erfahren, und hetzt den Polizeiagenten Spoletta auf ihre Spur.

(Scarpias Räume im Palazzo Farnese)

Scarpia lädt Tosca zu sich ein. Polizeiagent Spoletta berichtet von der vergeblichen Durchsuchung der Villa Cavaradossis. Dort wurde nicht der entflohene Häftling, sondern nur der Maler selbst angetroffen und zum Verhör mitgebracht. Als Cavaradossi sich weigert, seinen Freund Angelotti zu verraten, lässt Scarpia jenen in Anwesenheit Toscas foltern. Trotz der Folter verrät Cavaradossi seinen Freund nicht. Tosca jedoch gibt auf und gibt schließlich das Versteck Angelottis preis.

Als Cavaradossi aber mitbekommt, dass - entgegen den ersten Nachrichten - Napoléon gesiegt hat und nicht die italienischen und österreichischen Truppen, bekennt er sich zu seinen politischen Idealen. Scarpia erklärt, dass er damit sein Leben verwirkt habe.

Um das Leben Cavaradossis zu retten, verspricht Tosca, sich Scarpia hinzugeben.

Als Scarpia Tosca den Passierschein überreichen will, der ihr und Cavaradossi die Freiheit schenken soll, nimmt diese ein Messer und ersticht damit Scarpia. Angelotti bringt sich in diesem Akt selber um.

(Engelsburg)

Die Erschießung Cavaradossis auf der Plattform der Engelsburg wird vorbereitet. Dieser schreibt einen Abschiedsbrief an Tosca und erinnert sich ihrer und des schönen Lebens. Tosca hat sich mit dem Passierschein Scarpias in das Gefängnis begeben und teilt ihrem Geliebten mit, dass das Urteil nur zum Schein vollstreckt werden soll. Das Erschießungskommando erscheint und erschießt Cavaradossi. Tosca will ihm aufhelfen und muss erkennen, dass Scarpia auch sie betrogen hat: Cavaradossi ist wirklich tot. Inzwischen ist auch der Tod Scarpias entdeckt worden. Als Tosca deswegen von den Gendarmen verhaftet werden soll, stürzt sie sich von der Engelsburg in die Tiefe.